[صفحه اصلی ]   [Archive] [ English ]  
:: صفحه اصلي :: درباره نشريه :: آخرين شماره :: تمام شماره‌ها :: جستجو :: ثبت نام :: ارسال مقاله :: تماس با ما ::
.
بخش‌های اصلی
صفحه اصلی::
اطلاعات نشریه::
برای نویسندگان::
آرشیو مجله و مقالات::
برای داوران::
ثبت نام و اشتراک::
تماس با ما::
تسهیلات پایگاه::
::
جستجو در پایگاه

جستجوی پیشرفته
..
دریافت اطلاعات پایگاه
نشانی پست الکترونیک خود را برای دریافت اطلاعات و اخبار پایگاه، در کادر زیر وارد کنید.
..
IFRAME

..
:: دوره 18، شماره 1 - ( بهار 1402 ) ::
جلد 18 شماره 1 صفحات 126-119 برگشت به فهرست نسخه ها
کاربرد روش میکرو استخراج مایع-مایع پخشی کنترل شده با دما با استفاده از مایعات یونی در اندازه‌گیری باقیمانده‌های آموکسی‌سیلین، کلوگزاسیلین و اریترومایسین در نمونه‌های شیر گاو با استفاده از کروماتوگرافی‌مایع با کارائی بالا
محمدرضا افشار مقدم ، جلیل خندقی ، صمد وجدی حکم آباد*
استادیار گروه علوم دامی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی، سراب، ایران
واژه‌های کلیدی: آنتی‌بیوتیک، شیر، میکرواستخراج مایع-مایع پخشی، توسعه روش، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
متن کامل [PDF 545 kb]   (392 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (1184 مشاهده)
نوع مقاله: پژوهشي | موضوع مقاله: صنايع غذايي
دریافت: 1401/10/8 | پذیرش: 1401/11/18 | انتشار: 1402/1/26
متن کامل:   (179 مشاهده)
کاربرد روش میکرو استخراج مایع-مایع پخشی کنترل شده با دما با استفاده از مایعات یونی در اندازه‌گیری باقیمانده‌های آموکسی‌سیلین، کلوگزاسیلین و اریترومایسین در نمونه‌های شیر گاو با استفاده از کروماتوگرافی‌مایع با کارائی بالا
محمدرضا افشارمقدم1و2 ، جلیل خندقی 3و 4، صمد وجدی حکم‌آباد5

1- استادیار مرکز ایمنی غذا و دارو، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
2- استادیار مرکز آنالیز دارویی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
3- استادیار گروه علوم و صنایع غذایی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی ، سراب، ایران
4- استادیار گروه بیوتکنولوژی مواد غذایی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران
5- نویسنده مسئول: استادیار گروه علوم دامی، واحد سراب، دانشگاه آزاد اسلامی، سراب، ایران. پست الکترونیکی:  Samad.Vajdi@iausa.ac.ir
  
تاریخ دریافت: 6/10/1401                                                                                           تاریخ پذیرش: 15/12/1401
چکیده
سابقه و هدف: انواع مختلفی از آنتی بیوتیک‌ها در صنعت پرورش دام و به طور بی رویه برای رشد و درمان دام مورد استفاده قرار می‌گیرد که سبب تجمع باقیمانده‌های آنتی‌بیوتیکی در محصولات دامی مانند شیر خواهد‌شد. مصرف شیر آلوده به بقایای آنتی‌بیوتیک بالاتر از حد مجاز باعث ایجاد سمیت برای انسان و معضل بروز مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی می‌شود. به همین دلیل پایش باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها در شیر و لبنیات از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.
مواد و روشها: در این تحقیق روش میکرو استخراج مایع-مایع پخشی کنترل شده با دما با استفاده از مایعات یونی برای استخراج آنتی‌بیوتیک‌های آموکسی‌سیلین، کلوگزاسیلین و اریترومایسین از شیر گاو توسعه داده‌ شده و اندازه‌گیری کمی آنها به‌روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مجهز به شناساگر آرایه دیودی صورت گرفت. به‌علاوه اثر پارامترهای مختلف موثر در کارایی استخراج مانند حجم عامل رسوب دهنده و زمان ورتکس کردن و همچنین نوع و مقدار حلال استخراج‌کننده، اثر نمک‌زنی و دمای محلول آبی بهینه‌سازی شدند.
یافتهها: آنالیز نمونه‌های شیر وجود آموکسی سیلین در 8 نمونه شیر را نشان داد که همگی بالاتر از حد مجاز بودند. دیگر آنتی‌بیوتیک‌ها در نمونه‌های شیر یافت نشد. روش پیشنهادی از کارایی بالایی در استخراج باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌های هدف از نمونه‌های شیر برخوردار بود به‌طوریکه تکرارپذیری روش بر اساس درصد انحراف استاندارد نسبی 3 تا 5/4 بوده و تحت شرایط بهینه، کارایی روش پیشنهادی در استخراج آنالیت‌ها 87-78 درصد و حدود تشخیص و اندازه‌گیری به ترتیب کمتر از 1/1 و 7/3 نانوگرم در میلی‌لیتر بدست آمدند.
نتیجه گیری: روش توسعه داده شده برای اندازه‌گیری آنالیت‌های انتخابی در شیر گاو مناسب بوده و حد تشخیص آن کمتر از حداکثر مجاز تعیین شده برای باقیمانده این آنتی‌بیوتیک‌ها می‌باشد.
واژگان کلیدی: آنتی‌بیوتیک، شیر، میکرواستخراج مایع-مایع پخشی، توسعه روش، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
 
·  مقدمه
 
آنتی‌بیوتیک‌ها موادی هستند که قادر به کشتن یا مهار رشد میکروارگانیسم‌ها بوده و بخش عمده‌ای از آن‌ها در صنعت دامپروری و برای درمان و پیشگیری از بیماری‌ها استفاده می‌شود. همچنین برخی آنتی‌بیوتیک‌ها به‌عنوان محرک رشد به خوراک دام افزوده شده و سبب بهبود کارایی خوراک می‌گردد (1).
گرچه سلامت گله حیوانات در نهایت موجب دسترسی مصرف کنندگان به محصولات غذایی سالم و با کیفیت بالا و قیمت مناسب مانند گوشت و شیر می‌شود ولی از طرفی استفاده بی‌رویه از آنتی‌بیوتیک‌ها نیز مشکلات بهداشتی دیگری مانند معضل افزایش مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی و یا ایجاد واکنش‌های آلرژی، سمیت و سرطان‌زایی را به‌دنبال خواهد داشت. در حال حاضر میانگین جهانی مصرف سالانه مواد ضد میکروبی به ازای هر کیلوگرم وزن حیوان تولید شده بیش از 100 میلی‌گرم است (2).
به‌طور کلی، روش های تجزیه‌ای برای پایش باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها را می‌توان در دو گروه روش‌های غربالگری و تاییدی طبقه بندی کرد. روش‌های مهار میکروبی مانند روش چهار پلیتی  به ‌دلیل اینکه آسان و مقرون به صرفه بوده و قادرند آنتی‌بیوتیک‌های مختلف را در یک آزمایش واحد پوشش دهد، پرکاربردترین روش برای تشخیص و بخصوص غربالگری باقیمانده‌های آنتی‌بیوتیکی در مواد غذایی با منشاء دامی هستند اما دقت پایینی داشته و احتمال نمونه‌های مثبت کاذب در این روش زیاد است (3). از طرفی، با توجه به حدود مجاز (Maximum residue limits) توصیه شده برای باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها در محصولات غذایی توسط سازمان‌های نظارتی مانند اتحادیه اروپا (معمولاً ppb)، برای تشخیص مقادیر پایین روش های تجزیه‌ای حساس و کارآمد مورد نیاز است. که کروماتوگرافی مایع یکی از آن‌ها است (5، 4).
عموماً قبل از تجزیه دستگاهی نمونه‌ها، یک مرحله آماده‌سازی برای حذف ترکیبات مزاحم و پیش تغلیظ آنالیت‌ها مورد نیاز است (6). تاکنون روش‌های گوناگونی برای استخراج آنالیت‌های مختلف از مواد غذایی ارائه شده‌است که روش میکرواستخراج مایع-مایع پخشی یا DLLME (Dispersive Liquid-Liquid Microextraction) یکی از انواع متداول آن به‌شمار می‌رود (10-7). در این روش یک حلال پخش کننده قطبی و  یک حلال استخراج کننده غیرقطبی به محلول آبی تزریق و مخلوط نهایی برای جداسازی فازها سانتریفیوژ می شود. اخیراً مایعات یونی (Ionic liquids) دارای نقطه ذوب پایین، سمیت کمتر و همچنین سازگار با محیط زیست هستند، به عنوان یک استخراج کننده جایگزین برای روش DLLME پیشنهاد شده‌اند (12، 11).
هدف کار پژوهشی حاضر توسعه و معرفی یک روش کارآمد برای استخراج آنتی‌بیوتیک‌های آموکسی‌سیلین (Amoxicillin)، کلوگزاسیلین (Cloxacillin) و اریترومایسین (Erythromycin) از نمونه‌های شیر گاو بود. برای این‌منظور از روش میکرو استخراج مایع مایع پخشی کمک شده بوسیله مایعات یونی استفاده شده و سپس اندازه‌گیری باقیمانده‌های آنتی بیوتیکی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مجهز به شناساگر آرایه دیودی (HPLC–diode array detector)  انجام‌گرفت.
·  مواد و روشها
نمونه‌برداری و مواد شیمیایی
تعداد 30 نمونه شیر پاستوریزه در پاییز سال 1401 به‌صورت تصادفی از محل‌های عرضه در شهر تبریز تهیه و در آزمایشگاه مرکز ایمنی غذا و داروی دانشگاه علوم پزشکی‌تبریز تحت شرایط بهینه‌شده استخراج و آنالیز شدند. تری کلرواستیک اسید، 1-هگزیل-3-متیل ایمیدازولیوم تترا فلوئورو فسفات ([C6MIM][PF6])، 1-بوتیل-3-متیل ایمیدازولیوم تترا فلوئورو فسفات ([C4MIM][PF6]) و سدیم‌کلرید با درجه خلوص تجزیه¬ای از شرکت مرک (Darmstadt, Merck, Germany) و استاندارد آنتی‌بیوتیک‌های مورد بررسی از شرکت سیگما (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) تهیه شد. همچنین به­منظور کنترل کیفی سیستم کروماتوگرافی، محلول استاندارد آنتی‌بیوتیک‌ها (250 میلی­گرم در لیتر) هر روز سه‌بار به دستگاهHPLC  (Model 1200, DAD system, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA ) تزریق و فاکتور تغلیظ و راندمان استخراج مورد ارزیابی قرار گرفت. 
بهینه‌سازی شرایط استخراج
برای این منظور مقدار اسید تری‌کلرواستیک به‌عنوان عامل رسوب‌دهنده (از بین مقادیر50، 100، 150، 200 و 250 میلی‌گرم) و همچنین زمان ورتکس کردن (یک تا 5 دقیقه) قبل از سانتریفیوژ شیر برای جداسازی رسوب پروتئین‌های شیر  بهینه‌سازی شد. همچنین عوامل موثر در مرحله استخراج مایع-مایع پخشی شامل نوع حلال استخراج‌کننده (از بین مایعات یونی [C6MIM][PF6] و [C4MIM][PF6])، حجم حلال (با اضافه کردن مقادیر 50، 60 و 150 میکرولیتر)، اثر نمک‌زنی (با افزودن مقادیر متفاوتی از نمک در محدوده صفر تا 5 درصد وزنی-حجمی) و تنظیم دمای محلول آبی در دماهای 50 تا 90 درجه سلسیوس بهینه‌سازی گردید. برای بررسی عوامل مؤثر در روش توسعه داده‌شده از روش "یک پارامتر در یک زمان" استفاده و تاثیر این عوامل با مقایسه سطح زیر پیک حاصل از آنالیت­ها در شرایط مختلف بررسی شد (13). این آزمون‌ها و آزمون‌های اعتبار بخشی روش در 3 تکرار انجام و نتایج به‌صورت میانگین داده‌ها ± انحراف استاندارد بیان شدند.
روش استخراج
این مطالعه بر پایه روش استخراج مایع-مایع پخشی کنترل شده با دما  با استفاده از مایعات یونی به‌منظور استخراج باقیمانده‌های آنتی‌بیوتیکی از نمونه‌های شیر گاو توسعه داده‌شده و اندازه‌گیری آن‌ها به‌کمک کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا مجهز به شناساگر آرایه دیودی صورت گرفته‌است. برای این منظور، ابتدا مقدار 5 میلی‌لیتر نمونه شیر حاوی آنتی‌بیوتیک‌های مورد مطالعه به داخل یک لوله آزمایش منتقل و بر روی آن 150 میلی‌گرم تری کلرواستیک اسید اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 3 دقیقه ورتکس شده و سپس با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید. سپس 2 میلی لیتر از فاز رویی (حاوی آنتی بیوتیک های مورد مطالعه) برداشته شده و با 4 میلی لیتر محلول سدیم کلرید به غلظت 3 درصد وزنی-حجمی مخلوط شد. پس از آن، 50 میکرولیتر از مایع یونی 1-هگزیل-3-متیل ایمیدازولیوم تترا فلوئورو فسفات به داخل محلول آزمایشی اضافه و  محلول در داخل حمام آب در دمای 80 درجه سلسیوس قرار داده شد تا مایع یونی کاملآً حل شود. سپس محلول در داخل حمام آب یخ قرار گرفت. در این مرحله حلالیت مایع یونی در محلول آزمایشی کاسته شده و این حلال به صورت قطرات ریزی در داخل محلول پخش می شود. محلول ابری شکل حاصله سانتریفوژ شده و فاز ته‌نشین شده به سیستم HPLC-DAD تزریق شد. برای دستیابی به حداکثر تفکیک در سیستم کروماتوگرافی، شرایط کارکرد HPLC-DAD برای جداسازی آنتی‌بیوتیک‌ها مطابق جدول 1 انتخاب شد.
اعتبارسنجی روش
پس از ترسیم نمودار معیارگیری یا منحنی کالیبراسیون، مشخصات تجزیه­ای روش به‌کار رفته برای آنالیز آنتی‌بیوتیک‌ها، شامل فاکتورهایی از قبیل حد تشخیص (Limit of detection)، حد اندازه‌گیری (Limit of quantification)، تکرارپذیری (RSD%)، فاکتور تغلیظ و راندمان استخراج، ارزیابی و محاسبه شدند (14).
 · یافتهها
نتایج بهینه‌سازی پارامتر­های موثر در استخراج
حجم عامل رسوب دهنده: نتایج به‌دست آمده نشان داد که افزودن مقدار 150 میلی‌گرم از اسید تری کلرو استیک بهترین نتیجه را از نظر افزایش بازده استخراج سه آنالیت مورد مطالعه داشت. از این رو در ادامه مطالعه از این مقدار عامل رسوب دهنده استفاده شد.
مدت زمان ورتکس کردن نمونه: بررسی اثر این پارامتر با مخلوط نمودن نمونه‌های شیر پس از افزودن اسید و در زمان‌های مختلف صورت گرفت. نتایج نشان داد سه دقیقه ورتکس نمودن نمونه‌ها سبب افزایش سیگنال­های تجزیه‌ای شده و پس از آن بازده استخراج کاهش یافت.
اثر نمک زنی: افزودن نمک و افزایش قدرت یونی محیط تا مقدار 2 درصد وزنی/حجمی از کلرید سدیم منجر به افزایش کارایی استخراج شد. همانصور که در نمودار1 قابل مشاهده است، در استفاده از مقادیر بیشتر نمک سیگنال‌های تجزیه‌ای مربوط به آنالیت‌ها کاهش یافت لذا در ادامه مطالعه از افزودن 2 درصد نمک استفاده شد.
نوع حلال استخراج­کننده: در این راستا دو مایع‌ یونی مختلف مورد استفاده قرار گرفت.  چنان‌که در نمودار1 دیده می‌شود، حلال 1-هگزیل-3-متیل ایمیدازولیوم تترا فلوئورو فسفات دارای بیشترین کارایی در استخراج آنالیت­های مورد نظر بود و برای آزمایشات بعدی انتخاب شد.
حجم حلال: بررسی سیگنال­های تجزیه­ای بر اساس حجم حلال استخراج‌کننده نشان داد که افزایش حجم حلال از 50 به 70 میکرولیتر سبب تغییر راندمان استخراج آنالیت­های مورد مطالعه نشد. از این‌رو به دلیل مصرف کم حلال آلی، 50 میکرولیتر به‌عنوان حجم بهینه حلال انتخاب گردید.
دمای فاز آبی: دمای محلول حاوی نمونه نقش موثری در کارایی روش دارد و می‌تواند کارایی روش را بهبود بخشد. برای به دست آوردن دمای بهینه، آنالیزها در دماهای مختلف در محدوده 50 تا 90 درجه سلسیوس انجام شد. نتایج به‌دست‌آمده (شکل1) نشان داد که بازده استخراج آنالیت‌ها تا 80 درجه سلسیوس افزایش و سپس ثابت می‌ماند. لازم به توضیح است که در دماهای کمتر از 50 درجه سانتی‌گراد مایع یونی استفاده شده به عنوان حلال استخراج کننده در محلول نمونه حل نشد. 
 
جدول 1. شرایط بهینه‌ی کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا به منظور آنالیز باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها در نمونه‌های شیر گاو
نوع ستون ستون Xbridge C18 به طول 5 سانتی‌متر، قطر خارجی: 6/4 میلی‌متر و قطر ذرات: 5/3 میکرومتر
نوع شستشو شویش گرادیانی
ترکیب فازمتحرک حلال A: فرمیک اسید 2/0 درصد HPLC گرید، حلال B: مخلوط استونیتریل و متانول با نسبت حجمی 70 به 30 درصد با سرعت جریان 2/0 میلی‌لیتر در دقیقه
نحوه اعمال گرادیان 3 تا 6 دقیقه: گرادیان خطی از 20 تا 80 درصد حلال B
6-8 دقیقه: گرادیان خطی از 20 تا 80 درصد حلال A
2 دقیقه: حلال A= 80 درصد، حلال B= 20 درصد
تزریق‌کننده لوپ: 50 میکرولیتر و دمای ستون در 40 درجه سانتیگراد
طول‌موج آشکارسازی آموکسی‌سیلین در 335 نانومتر ، کلوگزاسیلین در 296 نانومتر و اریترومایسین در 275 نانومتر

شکل 1.  بهینه‌سازی عوامل موثر در کارایی روش پیشنهادی برای استخراج باقیمانده‌های آنتی‌بیوتیکی از شیر گاو
 
نتایج مشخصات تجزیه­ای
پارامترهای تجزیه‌­ای روش حاضر تحت شرایط بهینه محاسبه و ارائه گردیدند (14). منحنی‌های کالیبراسیون با اسپایک کردن هشت غلظت از آنالیت­های مورد مطالعه و رسم سیگنال تجزیه­ای آنالیت­ها پس از اجرای روش توسعه‌ یافته ترسیم شد و محدوده خطی روش برای هر یک از آنالیت­ها از منحنی کالیبراسیون بدست آمد. حد تشخیص و حد اندازه‌گیری روش به ترتیب برابر غلظت­هایی که در آن‌ها نسبت سیگنال به نویز به‌ترتیب 3 و 10 می‌باشد درنظر گرفته شد. تکرارپذیری و دقت روش با استفاده از انحراف استاندارد نسبی(RSD %)  حاصل شد. برای این‌منظور 6 محلول حاوی 25 نانوگرم در میلی‌لیتر از آنالیت­ها­ با شرایط یکسان و در حالت بهینه استخراج شدند. درصد RSD  بر اساس مساحت زیر پیک‌ها نشان از تکرارپذیری بالای روش ارائه شده دارد. نتایج اعتبارسنجی روش پیشنهادی در جدول 2 ارائه شده است.
 
جدول 2. مشخصات تجزیه‌ای روش پیشنهادی در استخراج باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها از نمونه‌های شیر گاو
  راندمان فاکتور     تغلیظ درصد انحراف استاندارد نسبی  (6 n=) حد اندازه‌گیری
(نانوگرم در میلی‌لیتر)
حد تشخیص
(نانوگرم در میلی‌لیتر)
ضریب تعیین (r2) محدوده  خطی
(نانوگرم در میلی‌لیتر)
حد مجاز
(نانوگرم در میلی‌لیتر)

آنالیت
بین روزها در یک روز
  78 ± 2  195±  5 6/3 0/3 7/3 1/1 998/0 500-7/3 4 آموکسی‌سیلین
  82 ± 4 205 ±10 1/4 2/3 0/3 9/0 994/0 500-0/3 30 کلوگزاسیلین
  87 ± 5 198± 11 5/4 7/3 0/2 6/0 999/0 500-0/2 40 اریترومایسین
 
آنالیز نمونه­های حقیقی
قابلیت روش پیشنهادی در استخراج آنتی‌بیوتیک­های مورد مطالعه و بررسی اثر بافت (Matrix) شیر در استخراج آنالیت‌ها با اندازه­گیری آن­ها در تعداد 30 نمونه­ شیر گاو تحت شرایط بهینه‌سازی شده انجام شد. کروماتوگرام­های HPLC-DAD حاصل نشان می‌دهند که تعداد 8 نمونه‌ شیر دارای باقیمانده آموکسی‌سیلین بوده و همگی آن‌ها بالاتر از حدمجاز باقیمانده یعنی 4 نانوگرم در میلی‌لیتر بود. دیگر آنتی‌بیوتیک‌های مورد مطالعه در نمونه‌ها یافت نشد.. شکل1 کروماتوگرام محلول استاندارد آنتی‌بیوتیک‌ها (هر کدام به غلظت 10 میلی­گرم در لیتر)، نمونه‌های شیر آلوده شده به آنالیت‌های انتخابی (50 میکروگرم در میلی‌لیتر) و یک نمونه حقیقی شیر نشان می‌دهد.

شکل 2. کروماتوگرام های HPLC-DAD محلول استاندارد (A)، نمونه شیر اسپایک شده با آنالیت‌های هدف (B) و نمونه شیر بدون اسپایک (C) پس از اجرای روش پیشنهادی. (1): آموکسی‌سیلین، (2): کلوگزاسیلین، (3): اریترومایسین.

به دلیل اینکه مواد مختلفی مانند پروتئین‌ها و لاکتوز موجود در بافت شیر ممکن است در اندازه‌گیری آنالیت‌ها تداخل ایجاد نماید، صحت روش و اثر بافت در کارایی روش ارائه شده از طریق استخراج آنتی‌بیوتیک­ها از نمونه‌های شیر اسپایک شده با غلظت­های مختلفی از محلول­های استاندارد تعیین گردید (14). مقادیر بازیابی نسبی بدست آمده نشان داد ماتریکس نمونه­ها در کارایی روش پیشنهادی تاثیر ناچیزی دارد.
جدول3. مطالعه اثر بافت شیر در کارایی روش استخراج باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها از نمونه‌های شیر گاو
آنالیت انحراف استاندارد ± مقادیر بازیابی نسبی
نمونه1 نمونه2 نمونه3 نمونه4 نمونه5
همه نمونه با مخلوط آنالیت‌ها به غلظت 5 نانوگرم در میلی‌لیتر اسپایک شدند
آموکسی‌سیلین 4±95 7±93 2±91 7±95   5±97
کلوگزاسیلین  2±94 4±90 5±94 5±96   4±97
اریترومایسین 4±99 2±97 2±98 5±93 6±92 
همه نمونه با مخلوط آنالیت‌ها به غلظت 50 نانوگرم در میلی‌لیتر اسپایک شدند
آموکسی‌سیلین 4± 92 3± 100 2± 96 3± 95 4± 90
کلوگزاسیلین  5± 90 4± 93 5± 94 3± 95 3± 93
اریترومایسین 3± 94 7± 92 4± 94 6± 95 3± 97 

·  بحث
عوامل رسوب‌دهنده می­توانند مزاحمت موادی از قبیل پروتئین‌ها، پلی­ساکاریدها، رنگدانه­ها و غیره را در استخراج آنالیت‌های فاز آبی شیر حذف کنند و یکی از روش‌های متداول این کار در نمونه‌های شیر استفاده از اسید تری کلرو استیک است (5). مقدار کم اسید تری­کلرواستیک قادر به رسوب‌دهی کامل پروتئین­ها نخواهد بود و از طرفی، مقدار زیاد آن نیز می­تواند سبب تغییر ماهیت نمونه شود لذا بهینه‌سازی مقدار آن لازم است (15).
یکی از پارامتر‌های مهم در اجرای روش استخراج توسعه داده شده، انتخاب نوع حلال استخراج‌کننده می‌باشد. حلال استخراج‌کننده بایستی حلالیت کمی در فاز آبی داشته و قابلیت پخش شدن در آن را داشته باشد. از طرف دیگر این حلال یا باید دارای دانسیته متفاوت از آب باشد تا جمع‌آوری آن با سانتریفیوژ ممکن باشد (6).
حجم این حلال نیز بازده استخراج و تکرارپذیری نتایج را تحت‌تاثیر قرار می‌دهد یعنی حجم بالای حلال سبب افزایش حجم فاز جمع‌شده پس از استخراج، کاهش فاکتور تغلیظ و بنابراین کاهش سیگنال‌های تجزیه‌ای خواهد شد. ضمنا کاهش حجم حلال نیز موجب کاهش کارایی استخراج و تکرارپذیری می‌گردد لذا حجم حلال‌ استخراج‌کننده باید بهینه‌سازی شود (16). در این مطالعه افزایش حجم حلال استخراج‌کننده در مقادیر بالاتر از 50 میکرولیتر تاثیری در افزایش سیگنال‌های تجزیه‌ای نداشت. لازم به‌ذکر است که در حجم‌های کمتر از 50 میکرولیتر حجم فاز ته نشین شده کم بوده و نتایج تکرارپذیر نبود.
ایجاد قدرت یونی محلول آزمایشی به‌وسیله افزایش کلرید سدیم ضمن اینکه می‌تواند سبب کاهش میزان دسترسی مولکول‌های آنالیت به آب و بنابراین انتقال آن­ها به داخل حلال استخراج­ کننده و در نتیجه افزایش کارایی استخراج ‌شود، از طرفی نیز ممکن است حل شدن حلال استخراج کننده در فاز آبی را کاهش داده و منجربه افزایش حجم فاز آلی جمع‌شده و کاهش سیگنال تجزیه‌ای در اثر رقیق‌­سازی شود (17). لذا یکی از پارامترهای موثر در اکثر روش‌های استخراج است که نیاز به ارزیابی و بهینه‌سازی دارد.
دمای فاز آبی از دیگر عوامل مؤثر در فرآیند پیشنهادی است به‌طوریکه گرم شدن محلول آبی می‌تواند موجب پخش بهتر حلال استخراج کننده در محلول آبی شده و با تغییر ضرایب انتشار سرعت استخراج را تحت تأثیر قرار دهد و در نتیجه، سطح تماس بین حلال و نمونه افزایش یافته و سرعت انتقال و استخراج آنالیت‌ها بهبود پیدا میکند. البته افزایش دما می‌تواند با انتشار بیشتر آنالیت‌ها به داخل فاز آبی سبب کاهش راندمان استخراج شود. بنابراین مقادیر سیگنال‌های تجزیه‌ای در دماهای مختلف تغییر خواهد کرد (18).
به‌منظور ارزیابی کارایی روش پیشنهادی در استخراج آنتی‌بیوتیک‌های انتخابی، برخی پارامترهای تجزیه‌ای روش حاضر با چند روش به‌کار رفته برای استخراج این آنالیت‌ها از نمونه‌های شیر مقایسه شد. این بررسی نشان داد مقادیر شایستگی روش ارائه شده قابل قبول می‌باشد به‌طوریکه حد تشخیص بدست برای آموکسی سیلین در تحقیق حاضر (1/1 نانوگرم در میلی‌لیتر)، قابل مقایسه با روش‌های انجام شده با کروماتوگرافی مایع مجهز به شناساگرهای بسیار حساس‌تر (LC-MS/MS) بود که در آن‌ها حد تشخیص این آنالیت یک نانوگرم در میلی‌لیتر (19) و 9/0 نانوگرم در میلی‌لیتر (20) بوده است. همچنین حد تشخیص کلوگزاسیلین بدست آمده (9/0 نانوگرم در میلی‌لیتر) پایین‌تر از مقادیر این پارامتر در بکارگیری روش LC-MS/MS در مطالعات دیگر یعنی 2 نانوگرم در میلی‌لیتر است (19). به‌علاوه حدود تشخیص اریترومایسین در دو تحقیق انجام شده بوسیله کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا 10 نانوگرم در میلی‌لیتر (21) و 25 نانوگرم در میلی‌لیتر (22) گزارش شده است که بسیار بالاتر از حد تشخیص بدست آمده در این کار (6/0 نانوگرم در میلی‌لیتر) می‌باشد. همچنین در مقایسه با سایر روش‌ها، روش توسعه داده شده مقادیر قابل قبولی برای راندمان استخراج (21، 19) و تکرارپذیری (22، 20) آنالیت‌های هدف ارائه کرده است.
نتیجه‌گیری
این کار پژوهشی روش میکرو استخراج مایع مایع پخشی کنترل شده با دما  با استفاده از مایعات یونی برای استخراج و پیش‌تغلیظ باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌های آموکسی‌سیلین، کلوگزاسیلین و اریترومایسین در نمونه‌های شیر گاو با استفاده از کروماتوگرافی‌مایع با کارائی بالا استفاده شد. سادگی روش، قابل اعتماد بودن، مصرف حلال­های سبز و با سمیت کمتر را می‌توان از جمله مزایای روش توسعه داده شده بر شمرد. اعتبار بخشی روش نشان دهنده پارامتر‌های تجزیه‌ای مطلوب بود به‌گونه‌ای که راندمان استخراج بالای 78 درصد و فاکتور تغلیظ بیش از 195 حاصل شد. همچنین حد تشخیص روش پیشنهادی کمتر از حداکثر مجاز تعیین شده برای باقیمانده این آنتی‌بیوتیک‌ها بود. روش مذکور به‌طور موفقیت‌آمیزی بر روی نمونه‌های شیر انجام گرفت و آنالیز نمونه‌های حقیقی فقط وجود آموکسی سیلین در 8 نمونه شیر را نشان داد که همگی بالاتر از حد مجاز بودند.

 
·   References
1.   Sachi S, Ferdous J, Sikder MH, Hussani SAK. Antibiotic residues in milk: Past, present, and future. J. Adv. Vet. Anim. Res. 2019;6(3):315.
2.   Jayalakshmi K, Paramasivam M, Sasikala M, Tamilam T, Sumithra A. Review on antibiotic residues in animal products and its impact on environments and human health. J Entomol Zool Stud. 2017;5(3):1446-51.
3.   Vishnuraj M, Kandeepan G, Rao K, Chand S, Kumbhar V. Occurrence, public health hazards and detection methods of antibiotic residues in foods of animal origin: A comprehensive review. Cogent Food & Agriculture. 2016;2(1):1235458.
4.   Ghasemi R, Mirzaei H, Mogaddam MRA, Khandaghi J, Javadi A. Application of magnetic ionic liquid-based air–assisted liquid–liquid microextraction followed by back-extraction optimized with centroid composite design for the extraction of antibiotics from milk samples prior to their determination by HPLC–DAD. Microchem. J. 2022;181:107764.
5.   Rasi H, AfsharMogaddam M, Khandaghi J. Application of a new extraction method coupled to high performance liquid chromatography for tetracyclines monitoring in cow milk. Journal of food science and technology (Iran). 2021;18(113):339-49 [in Persian].
6.   Meshkini K, Afshar Mogaddam M, Khandaghi J. Development of Homogeneous Liquid-Liquid Extraction in Combination with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Based on Deep Eutectic Solvents for the Extraction and Assessment of Phytosterols in Animal Cream Samples using Gas Chromatography Equipped with Flame Ionization Detector. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology. 2021;16(2):57-67 [in Persian].
7.   Rastpour N, Khandaghi J, Farajzadeh MA, Afshar Mogaddam MR. Deep eutectic solvent-based QuEChERS method combined with dispersive liquid–liquid microextraction for extraction of benzoylurea insecticides in cabbage leaves samples. Int. J. Environ. Anal. Chem. 2020; 102(12):2778-91.
8.   Limoei Khosrowshahi B, Marzi Khosrowshahi E, Afshar Mogaddam M, KHandaghi J. Use of Dispersive Solid-Phase Extraction in Combination with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction for the Assessment of Organophosphorus Pesticides in Fruit Juice Samples Using Gas Chromatography-Nitrogen-Phosphorus Detector. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology. 2022:87-98 [in Persian].
9.   Pirsa S, Alizadeh N. Rapid determination of pyridine derivatives by dispersive liquid–liquid microextraction coupled with gas chromatography/gas sensor based on nanostructured conducting polypyrrole. Talanta. 2011;87:249-54.
10. Pirsa S, Alizadeh N. Nanoporous conducting polypyrrole gas sensor coupled to a gas chromatograph for determination of aromatic hydrocarbons using dispersive liquid–liquid microextraction method. IEEE Sens. J. 2011;11(12):3400-5.
11. Gholizadeh S, Mirzaei H, Khandaghi J, Mogaddam MRA, Javadi A. Ultrasound–assisted solvent extraction combined with magnetic ionic liquid based-dispersive liquid–liquid microextraction for the extraction of mycotoxins from tea samples. J. Food Compost. Anal. 2022;114:104831.
12. Nie L, Cai C, Guo R, Yao S, Zhu Z, Hong Y, et al. Ionic Liquid-Assisted DLLME and SPME for the Determination of Contaminants in Food Samples. Separations. 2022;9(7):170.
13. Chandran S, Singh R. Comparison of various international guidelines for analytical method validation. Die Pharmazie-An Int. J. Pharm. Sci. 2007;62(1):4-14.
14. https://www.idbs.com/blog/2019/07/ich-m10-bioanalytical-method-validation-guideline-what-the-new-draft-means-for-bioanalysis. Access date: 11/14/2022.
15. Mogaddam MRA, Nemati M, Farajzadeh MA, Lotfipour F, Nabil AAA, Mohebbi A, et al. Application of natural deep eutectic solvents-based in-syringe dispersive liquid-liquid microextraction for the extraction of five acaricides in egg samples. Int. J. Environ. Anal. Chem.  2020:1-16.
16. Khani F, Khandaghi J, Farajzadeh MA, Afshar Mogaddam MR. Cold-induced Homogenous Liquid–Liquid Extraction Performed in a Refrigerated Centrifuge Combined with Deep Eutectic Solvent-based Dispersive Liquid–Liquid Microextraction for the Extraction of Some Endocrine Disrupting Compounds and Hydroxymethylfurfural from Honey Samples. Food Anal. Methods. 2021;14(10):2063-75.
17. Zare Sani M, Mogaddam MRA, Khandaghi J. Combination of cold induced HLLME with an effervescence-assisted DLLME based on deep eutectic solvent decomposition; application in extraction of some pyrethroid and carbamate pesticides from edible oils. Int. J. Environ. Anal. Chem.  2021:1-16.
18. Lemos VA, Oliveira LA. Ultrasound-assisted temperature-controlled ionic liquid microextraction for the preconcentration and determination of cadmium content in mussel samples. Food Control. 2015;50:901-6.
19. Holstege D, Puschner B, Whitehead G, Galey F. Screening and mass spectral confirmation of β-lactam antibiotic residues in milk using LC-MS/MS. J. Agric. Food Chem. 2002;50(2):406-11.
20. Martins-Júnior HA, Kussumi TA, Wang AY, Lebre DT. A rapid method to determine antibiotic residues in milk using liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry. J. Braz. Chem. Soc. 2007;18:397-405.
21. Xie Y, Hu Q, Zhao M, Cheng Y, Guo Y, Qian H, et al. Simultaneous determination of erythromycin, tetracycline, and chloramphenicol residue in raw milk by molecularly imprinted polymer mixed with solid-phase extraction. Food Anal. Methods. 2018;11(2):374-81.
22. Edder P, Coppex L, Cominoli A, Corvi C. Analysis of erythromycin and oleandomycin residues in food by high-performance liquid chromatography with fluorometric detection. Food Addit. Contam. 2002;19(3):232-40.
 

فهرست منابع
1. Sachi S, Ferdous J, Sikder MH, Hussani SAK. Antibiotic residues in milk: Past, present, and future. J. Adv. Vet. Anim. Res. 2019;6(3):315. [DOI:10.5455/javar.2019.f350]
2. Jayalakshmi K, Paramasivam M, Sasikala M, Tamilam T, Sumithra A. Review on antibiotic residues in animal products and its impact on environments and human health. J Entomol Zool Stud. 2017;5(3):1446-51.
3. Vishnuraj M, Kandeepan G, Rao K, Chand S, Kumbhar V. Occurrence, public health hazards and detection methods of antibiotic residues in foods of animal origin: A comprehensive review. Cogent Food & Agriculture. 2016;2(1):1235458. [DOI:10.1080/23311932.2016.1235458]
4. Ghasemi R, Mirzaei H, Mogaddam MRA, Khandaghi J, Javadi A. Application of magnetic ionic liquid-based air-assisted liquid-liquid microextraction followed by back-extraction optimized with centroid composite design for the extraction of antibiotics from milk samples prior to their determination by HPLC-DAD. Microchem. J. 2022;181:107764. [DOI:10.1016/j.microc.2022.107764]
5. Rasi H, AfsharMogaddam M, Khandaghi J. Application of a new extraction method coupled to high performance liquid chromatography for tetracyclines monitoring in cow milk. Journal of food science and technology (Iran). 2021;18(113):339-49 [in Persian]. [DOI:10.52547/fsct.18.113.339]
6. Meshkini K, Afshar Mogaddam M, Khandaghi J. Development of Homogeneous Liquid-Liquid Extraction in Combination with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Based on Deep Eutectic Solvents for the Extraction and Assessment of Phytosterols in Animal Cream Samples using Gas Chromatography Equipped with Flame Ionization Detector. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology. 2021;16(2):57-67 [in Persian]. [DOI:10.52547/nsft.16.2.57]
7. Rastpour N, Khandaghi J, Farajzadeh MA, Afshar Mogaddam MR. Deep eutectic solvent-based QuEChERS method combined with dispersive liquid-liquid microextraction for extraction of benzoylurea insecticides in cabbage leaves samples. Int. J. Environ. Anal. Chem. 2020; 102(12):2778-91. [DOI:10.1080/03067319.2020.1759568]
8. Limoei Khosrowshahi B, Marzi Khosrowshahi E, Afshar Mogaddam M, KHandaghi J. Use of Dispersive Solid-Phase Extraction in Combination with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction for the Assessment of Organophosphorus Pesticides in Fruit Juice Samples Using Gas Chromatography-Nitrogen-Phosphorus Detector. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology. 2022:87-98 [in Persian].
9. Pirsa S, Alizadeh N. Rapid determination of pyridine derivatives by dispersive liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography/gas sensor based on nanostructured conducting polypyrrole. Talanta. 2011;87:249-54. [DOI:10.1016/j.talanta.2011.10.006]
10. Pirsa S, Alizadeh N. Nanoporous conducting polypyrrole gas sensor coupled to a gas chromatograph for determination of aromatic hydrocarbons using dispersive liquid-liquid microextraction method. IEEE Sens. J. 2011;11(12):3400-5. [DOI:10.1109/JSEN.2011.2159970]
11. Gholizadeh S, Mirzaei H, Khandaghi J, Mogaddam MRA, Javadi A. Ultrasound-assisted solvent extraction combined with magnetic ionic liquid based-dispersive liquid-liquid microextraction for the extraction of mycotoxins from tea samples. J. Food Compost. Anal. 2022;114:104831. [DOI:10.1016/j.jfca.2022.104831]
12. Nie L, Cai C, Guo R, Yao S, Zhu Z, Hong Y, et al. Ionic Liquid-Assisted DLLME and SPME for the Determination of Contaminants in Food Samples. Separations. 2022;9(7):170. [DOI:10.3390/separations9070170]
13. Chandran S, Singh R. Comparison of various international guidelines for analytical method validation. Die Pharmazie-An Int. J. Pharm. Sci. 2007;62(1):4-14.
14. https://www.idbs.com/blog/2019/07/ich-m10-bioanalytical-method-validation-guideline-what-the-new-draft-means-for-bioanalysis. Access date: 11/14/2022.
15. Mogaddam MRA, Nemati M, Farajzadeh MA, Lotfipour F, Nabil AAA, Mohebbi A, et al. Application of natural deep eutectic solvents-based in-syringe dispersive liquid-liquid microextraction for the extraction of five acaricides in egg samples. Int. J. Environ. Anal. Chem. 2020:1-16. [DOI:10.1080/03067319.2020.1774568]
16. Khani F, Khandaghi J, Farajzadeh MA, Afshar Mogaddam MR. Cold-induced Homogenous Liquid-Liquid Extraction Performed in a Refrigerated Centrifuge Combined with Deep Eutectic Solvent-based Dispersive Liquid-Liquid Microextraction for the Extraction of Some Endocrine Disrupting Compounds and Hydroxymethylfurfural from Honey Samples. Food Anal. Methods. 2021;14(10):2063-75. [DOI:10.1007/s12161-021-02021-4]
17. Zare Sani M, Mogaddam MRA, Khandaghi J. Combination of cold induced HLLME with an effervescence-assisted DLLME based on deep eutectic solvent decomposition; application in extraction of some pyrethroid and carbamate pesticides from edible oils. Int. J. Environ. Anal. Chem. 2021:1-16. [DOI:10.1080/03067319.2021.1955110]
18. Lemos VA, Oliveira LA. Ultrasound-assisted temperature-controlled ionic liquid microextraction for the preconcentration and determination of cadmium content in mussel samples. Food Control. 2015;50:901-6. [DOI:10.1016/j.foodcont.2014.10.045]
19. Holstege D, Puschner B, Whitehead G, Galey F. Screening and mass spectral confirmation of β-lactam antibiotic residues in milk using LC-MS/MS. J. Agric. Food Chem. 2002;50(2):406-11. [DOI:10.1021/jf010994s]
20. Martins-Júnior HA, Kussumi TA, Wang AY, Lebre DT. A rapid method to determine antibiotic residues in milk using liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry. J. Braz. Chem. Soc. 2007;18:397-405. [DOI:10.1590/S0103-50532007000200023]
21. Xie Y, Hu Q, Zhao M, Cheng Y, Guo Y, Qian H, et al. Simultaneous determination of erythromycin, tetracycline, and chloramphenicol residue in raw milk by molecularly imprinted polymer mixed with solid-phase extraction. Food Anal. Methods. 2018;11(2):374-81. [DOI:10.1007/s12161-017-1008-x]
22. Edder P, Coppex L, Cominoli A, Corvi C. Analysis of erythromycin and oleandomycin residues in food by high-performance liquid chromatography with fluorometric detection. Food Addit. Contam. 2002;19(3):232-40. [DOI:10.1080/02652030110083702]
ارسال نظر درباره این مقاله
نام کاربری یا پست الکترونیک شما:

CAPTCHA


XML   English Abstract   Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Afshar Mogaddam M, Khandaghi J, Vajdi HokmAbad S. Use of Temperature-controlled Ionic Liquid-assisted Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Method for the Detection of Amoxicillin, Cloxacillin and Erythromycin Residues in Cow Milk using High Performance Liquid Chromatography. Iranian J Nutr Sci Food Technol 2023; 18 (1) :119-126
URL: http://nsft.sbmu.ac.ir/article-1-3607-fa.html

افشار مقدم محمدرضا، خندقی جلیل، وجدی حکم آباد صمد. کاربرد روش میکرو استخراج مایع-مایع پخشی کنترل شده با دما با استفاده از مایعات یونی در اندازه‌گیری باقیمانده‌های آموکسی‌سیلین، کلوگزاسیلین و اریترومایسین در نمونه‌های شیر گاو با استفاده از کروماتوگرافی‌مایع با کارائی بالا. علوم تغذیه و صنایع غذایی ایران. 1402; 18 (1) :119-126

URL: http://nsft.sbmu.ac.ir/article-1-3607-fa.html



بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.
دوره 18، شماره 1 - ( بهار 1402 ) برگشت به فهرست نسخه ها
Iranian Journal of  Nutrition Sciences and Food  Technology
Persian site map - English site map - Created in 0.07 seconds with 39 queries by YEKTAWEB 4692